| IMGT Web resources |
|
| Here you are: IMGT Web resources > IMGT Education > Tutorials > Sida et virus de l'immunodéficience de type-1 (VIH-1) |
Les mécanismes de l'activation de la transcription du virus de l'immunodéficience
humaine de type-1 (VIH-1) par Tat
Vanessa BRES
UPR CNRS 1142, Institut de Génétique Humaine
141 rue de la Cardonille 34396 Montpellier Cedex 5
SOMMAIRE
L'étude de la transcription du VIH-1 a permis des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes de régulation de l'expression transcriptionnelle des gènes, notamment via l'implication de nombreux facteurs d'origine cellulaire. C'est un excellent modèle pour essayer de comprendre les mécanismes généraux de la transcription en particulier parce que l'expression du facteur de transcription, d'origine virale, peut être contrôlée dans un système cellulaire. De plus la transcription est une étape cruciale de la réplication virale, absolument requise pour la dissémination et le développement du virus au sein de l'organisme infecté.
La première partie de ce chapitre sera consacrée au cycle de réplication du virus dont la compréhension est essentielle pour étudier l'étape de transcription. Par la suite, une attention plus particulière sera accordée à la protéine virale trans-activatrice Tat qui est le facteur de transcription viral requis pour l'étape de transcription et nécessaire à la réplication virale. Finalement, une dernière partie sera consacrée à la régulation, par Tat, de la transcription du promoteur du VIH-1. Dans cette partie seront détaillés les processus et les facteurs cellulaires et viraux intervenant dans cette étape.
A) Le VIH-1
Le virus de l'immunodéficience de type 1 (VIH-1) est un rétrovirus complexe, appartenant à la sous-famille des lentivirus c'est-à-dire des virus à réplication lente. La super famille des rétrovirus qui possède un ARN enveloppé est définie selon des dénominateurs communs de taxonomie qui incluent des propriétés spécifiques de structure, de composition et de réplication.
Depuis plus de 20 ans, le VIH-1 est l'objet de nombreuses investigations qui visent à comprendre les mécanismes d'infection conduisant au syndrome de l'immunodéficience acquise ou SIDA chez les patients.
Le génome du VIH-1 est flanqué de 2 régions répétées ou LTRs (long terminal repeats) qui se composent de 3 domaines U3, R et U5. Il code pour 9 cadres ouverts de lecture. Trois codent pour les polyprotéines Gag, Pol et Env, communes à tous les rétrovirus, qui sont protéolysées en protéines individuelles et 6 codent pour des protéines régulatrices (Figure 14). Structurellement, le VIH-1 se résume à un ensemble de 15 protéines et 2 ARNs de ~9-kb (Frankel and Young, 1998).
A-1) Structure du virion
Le virion, encore appelé particule virale est l'entité infectieuse du virus (Figure 15). Il mesure entre 80 et 100 nm de diamètre et se compose de protéines virales, cellulaires et de 2 ARNs viraux.
A-1-1) Les protéines virales
La majeure partie des protéines virales du VIH-1 composent ou sont incorporées dans la particule virale exceptée deux protéines régulatrices, Tat et Rev, qui à ce jour n'ont pas été détectées.
A-1-1-1) Les protéines de structure
La protéine Gag, codée par le gène gag, est le précurseur des protéines structurales internes de tous les rétrovirus. Le clivage de la protéine, qui a lieu lors de la maturation des particules virales à l'extérieur de la cellule, donne naissance aux protéines de la matrice (MA p17), à la capside (CA p24), à la nucléocapside (NC p17) et à la protéine p6.
Le gène env code pour la gp160 qui est le précurseur de deux protéines différentes : la protéine de surface (SU gp120) et la protéine trans-membranaire (TM gp41). Ces protéines, présentes à la surface de la membrane des virions, sont le premier déterminant du type de cellules pouvant être infecté puisqu'elles reconnaissent des récepteurs cellulaires de surface.
A-1-1-2) Les protéines enzymatiques
Les protéines enzymatiques sont codées par un gène commun : le gène pol. Les 3 protéines enzymatiques communes à tous les rétrovirus et nécessaires au cours des différentes étapes du cycle viral sont la reverse transcriptase (RT) qui possède une activité additionnelle Rnase H, l'intégrase (IN) et la protéase (PR).
A-1-1-3) Les protéines régulatrices
Le génome du VIH-1 code pour 6 protéines régulatrices. Toutes sont essentielles à la propagation du virus mais seulement 4 ont, à ce jour, été détectées dans le virion. La protéine régulatrice la plus représentée est Vpr qui a été trouvée comme étant associée à la protéine p6. Quant aux protéines Vif, Nef et Vpu, elles représenteraient moins de 1% de l'ensemble des protéines Gag.
A-1-2) Les protéines cellulaires
Trois types de protéines cellulaires sont représentées dans le virion : des protéines cytoplasmiques, nucléaires et membranaires.
L'approche double-hybride a permis de montrer que la CyclophilineA interagit avec Gag et l'IN (Franke et al., 1994; Thali et al., 1994). Via cette interaction, la CyclophilineA est contenue dans les virions du VIH-1. L'ubiquitine, est également associée à la particule virale sous forme libre ou liée à p6 (Ott et al., 1998). En outre, il existe des évidences biochimiques qui ont montré que la F-actine, composant du cytosquelette, interagit avec Gag et est incorporée dans les virions (Ott et al., 1996; Rey et al., 1996). Ensuite, la protéine nucléaire INI1, connue aussi sous le nom de hSNF5, composant du complexe SWI/SNF, est aussi incorporée dans le virion et semble nécessaire pour la production efficace des particules virales (Yung et al., 2001). Des enzymes de type tyrosine kinase, associées à la MA, ont aussi été détectées dans les particules virales (Camaur et al., 1997). Enfin, des glycoprotéines de surface telles que les protéines du complexe majeur d'histocompatibilité I sont présentes dans le virion, et ce en quantité peu différente des protéines d'enveloppe virales (Arthur et al., 1992).
A-1-3) L'ARN viral
Avec ses ~9 kb, l'ARN viral est le composant majeur de la particule infectieuse. La partie localisée en 5' comporte les domaines R et U5 qui sont nécessaires à l'activation et au contrôle de la transcription, alors que celle en 3' possède les signaux terminateurs de transcription dont le signal de polyadénylation. L'ARN viral code pour le génome viral et contient des régions essentielles qui, depuis la partie 5', sont les suivantes :
(revue dans (Frankel and Young, 1998)).
A-2) Le cycle viral
Le cycle de réplication du VIH-1 peut-être décomposé en plusieurs étapes successives, depuis l'entrée du virus dans la cellule hôte jusqu'à la libération de nouvelles particules virales à l'extérieur de la cellule (Figure 16).
A-2-1) Récepteurs et co-récepteurs
Le VIH-1 infecte les cellules qui expriment le récepteur CD4 c'est-à-dire les lymphocytes T CD4+, les cellules de la lignée monocyte/macrophage et les cellules microgliales du cerveau et il est à noter que de rares souches sont capables d'infecter des cellules CD8+.
L'expression seule de CD4 ne suffit pas car certains isolats de virus infectent préférentiellement les lymphocytes T CD4+ ou les monocytes/macrophages primaires, définissant ainsi les virus à tropisme-T et ceux à tropisme-M. L'infection par le VIH-1 nécessite un second récepteur ou co-récepteur : CCR5, récepteur des chimiokines C-C, est essentiel à l'entrée des virus de tropisme-M, alors que CXCR4, récepteur aux chimiokines CXC, médie l'entrée des virus de tropisme-T. Les virus qui utilisent CCR5 ou CXCR4 sont appelés virus R5 ou X4 et ceux qui utilisent les 2 sont définis sous le nom de virus R5X4. D'autres récepteurs aux chimiokines, principalement CCR3, CCR2b, fonctionnent comme des co-récepteurs mineurs pour le VIH-1. En outre CCR3, avec CCR5, est requis au niveau des cellules microgliales pour le tropisme-M (revue dans (Moore et al., 1997)). Des récepteurs de surface, incluant la protéine liant le mannose, sur les macrophages peuvent interagir avec la gp120 sans pour autant entraîner la fusion et l'entrée du virus. Cependant, ces récepteurs pourraient permettre aux particules virales de s'accoler aux cellules et d'établir plus facilement une interaction avec CD4 et/ou des co-récepteurs dont les concentrations seraient sub-optimales. Enfin des lectines spécifiques des cellules dendritiques DC-SIGN qui permettent le regroupement de ces cellules avec les lymphocytes T, interagissent aussi avec les glycoprotéines d'enveloppe du VIH-1 permettant la capture efficace du virus par les cellules dendritiques (revue dans (Clapham and McKnight, 2001)).
A-2-2) L'entrée
L'entrée est initiée par une interaction de haute affinité entre la gp120 et le CD4 (Lasky et al., 1987). Cette liaison entraîne un changement de conformation de la gp120 ayant pour conséquence une interaction avec CCR5 (Wu et al., 1996). Cette nouvelle interaction avec le co-récepteur permet un changement de conformation supplémentaire du complexe glycoprotéique d'enveloppe dont un démasquage d'un domaine de la gp 41 conduisant à la fusion entre la membrane cellulaire et virale (Wild et al., 1994) (revue dans (Moore et al., 1997)), exposant ainsi l'ensemble des composants viraux à l'intérieur de la cellules.
A noter qu'il existe aussi des infections CD4 indépendantes, elles font intervenir les co-récepteurs mais pas CD4 (Reeves et al., 1997).
A-2-3) La reverse transcription
Cette étape est essentielle à la réplication de tous les rétrovirus. Elle nécessite une enzyme virale : la RT et son activité RNAseH. Le tRNA3lys, d'origine cellulaire mais intégré dans la particule virale (Jiang et al., 1993) via sa fixation au PBS sert d'amorce. La NCp7 semble servir de chaperon pour acide nucléique dans cette étape puisqu'elle permettrait son amorçage (Remy et al., 1998). Ensuite, la RT catalyse les réactions de polymérisation de l'ADN dépendante de l'ARN et de l'ADN. La RNAseH détruit les portions d'ARN et les duplex ARN/ADN formés aux cours de la reverse transcription (revue dans (Katz and Skalka, 1994)). L'aspect intéressant de ce mécanisme est que la synthèse du brin complémentaire s'opère par "sauts de brin", phénomène qui permet la synthèse des régions U3, R et U5 qui flanquent le génome du VIH-1.
A-2-4) La translocation nucléaire du complexe de pré-intégration
Le complexe de pré-intégration ou PIC (preintegration complex) est composé de l'acide nucléique viral et d'un certain nombre de protéines virales dont MA, RT, IN et Vpr (Miller et al., 1997). L'import nucléaire, actif lors de l'interphase, est favorisé par la présence des séquences de localisation nucléaire situées sur les protéines MA, IN et par Vpr (revue dans (Sherman and Greene, 2002)). En outre, des séquences ADN Flap, localisées au centre du génome du VIH-1, sont importantes pour l'import nucléaire de l'ADN viral (Zennou et al., 2000). Enfin, une étude de Farnet et Bushman a montré que HMG I, une protéine chromosomale non-histone, importante pour le contrôle de la transcription et l'architecture de la chromatine, était associée au complexe PIC. La fonction de cette protéine au sein du complexe PIC serait de promouvoir l'intégration de L'ADN viral (Farnet and Bushman, 1997).
A-2-5) L'intégration
L'intégration, comme la reverse transcription, est une étape complexe et bien étudiée. Elle est catalysée par l'IN et des facteurs cellulaires et permet à l'ADN rétroviral de s'insérer dans le génome de l'hôte et d'adopter une structure chromatinienne. L'IN est une activité recombinase qui par une réaction coupant et liant l'ADN va permettre la liaison covalente du génome viral à l'ADN cellulaire pour former le provirus. L'IN du VIH-1 interagit avec hSNF5 (Kalpana et al., 1994; Wang et al., 1996), un composant du complexe SWI/SNF intervenant dans le remodelage de la chromatine. Ainsi, l'intégration du génome viral pourrait être facilitée par la présence de ce type de facteur qui favoriserait l'environnement chromatinien au profit du virus.
A-2-6) La transcription
Cette étape particulièrement régulée, fera l'objet d'un paragraphe. Brièvement, la transcription du VIH-1 permettant la synthèse des ARN messagers viraux, met en jeu les éléments ADN et ARN présents dans les LTRs viraux, des facteurs cellulaires impliqués dans la transcription et la protéine virale Tat.
A-2-7) La maturation des ARN messagers viraux et traduction
Les ARN messagers cellulaires qui sont exportés depuis le noyau vers le cytoplasme lorsqu'ils sont complètement maturés alors que les ARN messagers viraux sont exportés sous une forme immature. Les ARN messagers multi-épissés qui sont générés à partir du transcript primaire codent pour les protéines d'expression précoce Tat, Rev et Nef. Ces ARNs sont traduits tôt indépendamment de Rev. En revanche, l'accumulation de Rev dans le noyau facilite alors l'export des ARNs non-épissés codant pour le précurseur Gag et des ARN messagers codant pour les autres protéines virales (Hope, 1997) permettant ainsi leur expression dans le cytoplasme.
A-2-8) L'assemblage et le re-largage des particules virales
L'assemblage des protéines virales a lieu au niveau de la membrane plasmique et fait intervenir les protéines Gag. La particule virale, encore immature, est relarguée via des processus encore mal connus. Cependant une étude récente suggèrerait que l'ubiquitination de Gag serait importante pour l'exocytose des particules virales (Strack et al., 2002).
B) La protéine Tat
Tat est une petite protéine nucléaire composée de 72 ou 101 acides aminés. Elle est codée par 2 exons localisés de part et d'autre du gène env. Cette protéine est exprimée très tôt au cours du cycle viral, indépendamment de la présence de Rev (Jones and Peterlin, 1994; Taube et al., 1999).
Malgré sa petite taille, elle est structurellement assez complexe et comporte plusieurs régions fonctionnelles. Tat est un facteur de transcription, essentiel à l'expression des gènes viraux, à la réplication et à la pathogenèse du VIH-1 (revue dans (Cullen, 1998; Emerman and Malim, 1998; Isel and Karn, 1999; Jeang et al., 1999; Jones, 1997; Taube et al., 1999)). Enfin, de nombreuses études ont montré que, indépendamment de son activité transcriptionnelle, Tat était aussi impliquée dans d'autres fonctions (revue dans (Jeang et al., 1999)).
B-1) Structure
On distingue 5 régions fonctionnelles qui constituent la protéine Tat : la partie amino-terminale (de 1 à 21 aa), une région riche en cystéine (de 22 à 37 aa), le coeur (de 38 à 48 aa), la région basique riche en arginines et en lysines (de 49 à 57 aa) et la partie carboxy-terminale (Jones, 1997). Le second exon commence à partir de l'acide aminé 73 (Figure 17).
Les séquences amino-terminales, riches en cystéines et le coeur représentent le domaine d'activation de la protéine. Dans ce domaine 6 des 7 cystéines présentent entre les acides aminés 22 et 37 sont essentielles à l'activité de Tat (Garcia et al., 1988; Jeang et al., 1999; Rice and Carlotti, 1990). Par ailleurs, cette région de la protéine est également requise pour établir des interactions avec des partenaires. Les cations divalents et plus particulièrement le zinc sont nécessaires pour ces interactions mais aussi pour un bon repliement de la protéine (Garber et al., 1998; Jones, 1997). Enfin l'intégrité de la région basique, encore appelée ARM (arginine rich motif), est essentielle à l'interaction entre Tat et la structure en boucle composée de 3 résidus U de TAR (transactivation response) (Dingwall et al., 1990; Dingwall et al., 1989; Rana and Jeang, 1999) et plus particulièrement la lysine 50 de Tat qui interagirait directement avec le résidu 34 de la structure tige-boucle (Richter et al., 2002). Le domaine ARM est important aussi pour la localisation nucléaire de la protéine (Hauber et al., 1989; Ruben et al., 1989) et pour son absorbtion par les cellules avoisinantes (Chang et al., 1995).
B-2) Fonctions
Tat est le facteur de transcription absolument nécessaire à la réplication virale. Cette activité de Tat est de loin la plus étudiée, cependant, des études issues de différents laboratoires ont montré que Tat était aussi impliquée dans d'autres fonctions essentielles au développement du virus.
B-2-1) Fonction trans-activatrice
De plus en plus de données sont connues sur cette fonction de Tat. Tat est un facteur de transcription atypique puisqu'il fonctionne en se liant non pas à l'ADN mais à une structure ARN de 59 nucléotides appelé TAR localisée en 5' de tous les ARN messagers viraux (Berkhout et al., 1989) (Figure 18).
Cette liaison est nécessaire à la transcription, à la fois in vivo (Calnan et al., 1991; Roy et al., 1990) et in vitro (Marciniak et al., 1990). La transcription par Tat nécessite de nombreux partenaires cellulaires qui interviennent à différentes étapes de ce processus. Il est toutefois important de noter que ces co-facteurs peuvent avoir des conséquences directes sur la nature de la protéine Tat en la modifiant de façon post-traductionnelle. La première modification qui a été caractérisée est l'acétylation de lysines (Col et al., 2001; Deng et al., 2000; Kiernan et al., 1999; Ott et al., 1999). Ce type de modification fait intervenir de nouvelles régulations et un contrôle plus étroit de l'activité transcriptionelle par Tat. L' implication respective des facteurs cellulaires intervenant dans la transcription par Tat ainsi que l'importance des modifications post-traductionnelles de Tat seront décrites dans le chapitre suivant.
Par ailleurs, Tat est aussi capable d'activer la transcription indépendamment de TAR en activant la translocation nucléaire de NF-kB (Demarchi et al., 1996). L'intégrité du domaine basique de Tat est requis car il permet l'interaction avec la protéine kinase PKR in vivo et in vitro (Brand et al., 1997; McMillan et al., 1995). La PKR permet la phosphorylation d'IkB, protéine qui séquestre NF-kB dans le cytoplasme. Cette phosphorylation conduit à la dégradation d'IkB et donc la libération et la translocation vers le noyau de NF-kB (Demarchi et al., 1999; Kumar et al., 1994) (revue dans (Marcello et al., 2001)).
B-2-2) Autres fonctions
Le génome du VIH-1, bien que de taille largement inférieure à celui des virus de la famille des herpes par exemple, contient toutes les informations permettant un réplication virale efficace au même titre que les virus possédant des génomes plus complexes. Ainsi il est fortement possible que chaque cadre ouvert de lecture du VIH-1 ait été sélectionné pour pouvoir évoluer et coder pour des protéines aux fonctions multiples. C'est le cas notamment de la protéine Tat qui, à partir d'évidence génétique, a été impliquée dans des fonctions différentes de la transcription (Huang et al., 1994).
Deux groupes différents ont suggéré que Tat jouerait un rôle dans la reverse transcription de l'ARN viral (Harrich et al., 1997; Kameoka et al., 2001). En effet, Harrich et coll. ont montré que la synthèse de particules virales, en absence de Tat, entraîne une absence de reverse transcription alors que cette activité est rétablie lorsque les virus n'exprimant pas la protéine sont produits en sa présence. En outre, récemment le laboratoire de Wainberg a suggéré que via une activité de liaison à l'ARN similaire à celle de la NCp7, Tat permettrait le placement des amorces tRNA sur l'ARN viral nécessaire à la reverse transcription (Kameoka et al., 2002). Toutefois, l'implication directe de Tat dans la reverse transcription est difficile à appréhender. Pour ce faire, soit Tat doit être incorporée dans la particule virale, ce qui a ce jour n'a jamais été montré malgré l'existence de techniques sensibles de détection, soit Tat a un effet en amont de cette étape du cycle virale. En accord avec cette idée, une étude récente suggère que Tat via son interaction avec Tat-SF1, pourrait jouer un rôle dans l'étape d'épissage des ARNs messagers (Fong and Zhou, 2001). Ainsi, l'absence de Tat pourrait entraîner un défaut dans la composition des virions dont une des conséquences indirectes serait une reverse transcription défective.
Ensuite, le Tat exogène, très toxique pour les cellules, augmenterait l'efficacité de dissémination du virus et diminuerait l'immunité antivirale dans le but de développer la maladie (Gallo, 1999). En inhibant l'entrée et la réplication des cellules T exprimant le co-récepteurs CXR4 mais pas celles exprimant CCR5, le Tat exogène permettrait aussi une sélection contre les virus à tropisme X4, influençant ainsi le développement précoce de la maladie (Ghezzi et al., 2000; Xiao et al., 2000). Par ailleurs, la protéine Tat contrôle aussi l'expression de différents gènes, comme par exemple le gène des interleukines dont l'IL8 qu'elle induit (Ott et al., 1998), préparant ainsi l'environnement cellulaire à l'infection. En modifiant le degré d'activation immune chez les individus infectés, Tat pourrait aider à l'infection des lymphocytes T quiescents par le VIH-1 (Ott et al., 1997; Westendorp et al., 1994). En outre, il a récemment été montré par Col et coll. que les 15 derniers acides aminés de la partie C-terminale de la protéine Tat étaient capables d'inhiber l'acétylation des histones par CBP et GCN5 suggérant que Tat pourrait induire une sélectivité du substrat ciblé par ces activités HATs (Col et al., 2002). Enfin le traitement des cellules par Tat entraînerait l'activation des lymphocytes-T quiescents (Ott et al., 1997), une augmentation de l'expression des récepteurs aux chimiokines (Huang et al., 1998; Secchiero et al., 1999) facilitant ainsi l'infection des cellules saines, une diminution de la prolifération (Viscidi et al., 1989; Zagury et al., 1998) et l'apoptose des cellules voisines non infectées (Li et al., 1995; Westendorp et al., 1995).
Pour conclure, outre l'implication de Tat dans différentes étapes absolument cruciales de la réplication virale : transcription, reverse transcription et plus récemment, par l'intermédiaire d'un facteur associé, dans l'épissage des ARNs messagers, des travaux divers montrent que Tat est un atout majeur du virus favorisant l'expression ou l'inhibition des différents médiateurs cellulaires impliqués dans son développement et l'évolution de la maladie.
C) L'activation de la transcription du promoteur de VIH-1 par Tat
Après la reverse transcription l'ADN viral porteur de l'information génétique est importé dans le noyau cellulaire où il est intégré aux chromosomes de l'hôte grâce à l'IN. L'ADN viral adopte alors une structure chromatinienne similaire à celle de l'ADN cellulaire. Lors de l'activation des cellules des promoteurs sont activés dont celui du VIH-1. Cette activation met en œuvre la protéine virale Tat et des facteurs cellulaires qui agissent en synergie pour permettre la régulation de la transcription et l'expression des gènes viraux.
C-1) Importance des sites d'intégration
La chromatine des eucaryotes est plus ou moins compacte suivant sa localisation. L'existence de l'hétérochromatine et de l'euchromatine fait que le site d'intégration de l'ADN viral doit être important pour la régulation transcriptionnelle de l'expression de ses gènes. Une étude sur plus de 60 sites d'intégration du VIH-1 a été faite par Stevens et Griffith montrant qu'il n'y avait pas de site spécifique d'intégration ni à proximité des unités transcriptionelles ou ni à côté d'éléments répétitifs (Stevens and Griffith, 1996). D'autres études in vitro ont montré que l'intégration avait préférentiellement lieu dans les régions d'ADN nucléosomal probablement grâce à la distorsion de l'ADN autour des histones (Muller and Varmus, 1994; Pruss et al., 1994). Dans le cas du VIH-1, l'IN interagit avec INI1/SNF5, un composant du complexe SWI/SNF dépendent de l'ATP qui contribue au remodelage de la chromatine (Kalpana et al., 1994). Ainsi, le recrutement de ce complexe pourrait aider un remodelage de la chromatine au site d'intégration, facilitant ainsi l'intégration (Miller and Bushman, 1995). En accord avec cette idée, plus récemment, il a été suggéré que l'intégration du VIH-1 était même défavorisée dans l'hétérochromatine (Carteau et al., 1998). D'après Jordan et coll., l'environnement chromatinien du promoteur du VIH-1 serait important pour son contrôle puisqu'en absence de Tat et indépendamment des facteurs cellulaires, une importante hétérogénéité dans l'activation du LTR du VIH-1 est observée (Jordan et al., 2001). Enfin, une étude récente de Bushman et coll. montre qu'il existe une étroite corrélation entre l'activité des gènes et les sites d'intégration du VIH-1 particulièrement au niveau des gènes activés dans les cellules après l'infection par le VIH-1 suggérant ainsi une spécificité dans le choix du site d'intégration (Schroder et al., 2002). Cette dernière étude suggère pour la première fois, en ce qui concerne le VIH-1, que les facteurs impliqués dans l'activation des gènes pourraient permettre, via des interactions avec des composants du complexe de pré-intégration, d'intégrer le génome viral dans des sites spécifiques bénéficiant d'un environnement chromatinien favorable.
C-2) Le promoteur du VIH-1
Lorsque le génome du VIH-1 est compacté dans la chromatine, il a été montré que la région promotrice contient des nucléosomes qui sont positionnés spécifiquement par rapport aux régions régulatrices du promoteur, ce indépendamment du site d'intégration (El Kharroubi et al., 1998; Pazin et al., 1996; Van Lint et al., 1997; Verdin et al., 1993). Lorsque la transcription n'est pas active, ces nucléosomes définissent 2 régions, qui contiennent des sites d'hypersensibilités à la DNAse I (HS2 + HS3 et HS4) : de 200 à 465 et de 601 à 720, par rapport au +1 de la transcription, défini au nucléotide 462. Ces deux régions sont séparées par un nucléosome unique appelé nuc-1 (nucléotides 465 à 610) (Verdin, 1991; Verdin et al., 1993). Le génome du VIH-1 est flanqué par 2 LTRs qui contiennent les régions de liaison à différents facteurs cellulaires régulant la transcription. Le LTR du VIH-1 peut-être décomposé en 3 parties appelées U3, R et U5 (Figure 19). Ces 3 régions possèdent 4 domaines fonctionnels importants pour la régulation de la transcription :
Les 3 derniers domaines sont localisés dans la région U3 (Gaynor, 1992).
Que la transcription soit activée ou que les cellules infectées soient dans un état latent, des expériences d'empreintes génomiques ont montrés que ces sites de liaisons aux facteurs de transcription étaient occupés par des protéines dans les 2 situations (Demarchi et al., 1993) suggérant que l'activation de la transcription ne soit pas régulée uniquement par l'accessibilité des sites cibles mais par des interactions protéines/protéines.
Par ailleurs, d'autres sites, localisés en R et U5 des LTRs, c'est-à-dire après le +1 de la transcription ont été montrés comme étant importants (el Kharroubi and Verdin, 1994; Van Lint et al., 1997). Des analyses d'empreintes génomiques in vivo et in vitro ont permis d'identifier 4 régions. La première est composée de 3 sites de liaisons à AP1 (site I nucléotides 541 à 547, site II nucléotides 572 à 578 et site III nucléotides 609 à 615), la seconde, d'un motif semblable à AP3 ou AP3-L (nucléotides 617 à 626), la troisième, le site DBF qui a plus tard été montré comme étant un site de liaison aux facteurs de réponse aux interférons ou IRF (nucléotides 653 à 677) et enfin la dernière région qui contient 2 sites juxtaposés de liaison à Sp1 (Figure 19). Des mutations combinées au niveau de ces régions affectent sévèrement la réplication du virus et la transcription du promoteur du VIH-1 suggérant un rôle régulateur important de ces domaines (Van Lint et al., 1997).
C-3) Chromatine et VIH-1
L'étude de l'organisation chromatinienne du VIH-1 a été faite à partir de plusieurs lignées cellulaires contenant un seul provirus intégré à différents sites du génome cellulaire. Dans ces cellules, le provirus est transcriptionnellement silencieux, cependant, la transcription peut-être activée par des traitements à plusieurs composés biologiques tels que le TNF-α ou les esters de phorbol. Lors de l'activation de la transcription nuc-1 est rapidement et spécifiquement déstabilisé. Ainsi, la position de nuc-1 au +1 de la transcription et sa déstabilisation lors de l'activation transcriptionelle suggèrent que la chromatine joue un rôle essentiel dans la répression de la transcription du VIH-1 lors des phases de latence. De plus, cette déstabilisation est absolument requise pour l'activation de la transcription mais elle est indépendante de l'ARNPII puisque insensible à l'α-amanitine. Ainsi, la localisation de nuc-1, au niveau du +1 de la transcription et le fait que le blocage de l'élongation de la transcription se fasse au même site suggèrent que nuc-1 puisse jouer un rôle direct dans l'inhibition de la transcription. Nuc-1 pourrait médier cette inhibition en augmentant la pause de l'ARNPII ou en bloquant la liaison des facteurs de transcription cruciaux à l'assemblage du complexe de transcription. En accord avec cette notion, des observations ont été faites sur l'effet des inhibiteurs des HDACs. Des composés tels que le sodium butyrate (Laughlin et al., 1995), la trapoxine et la trichostatine A ou TSA (Van Lint et al., 1996) entraînent une activation remarquable de l'expression de gènes étant sous le contrôle du LTR. Ces résultats suggèrent que le promoteur du VIH-1 appartienne à la famille des gènes dont l'activation de la transcription est modulée par l'acétylation / déacétylation des histones. Cependant à ce jour aucune donnée ne permet de savoir si ces inhibiteurs des HDACs agissent directement sur la chromatine ou si les effets observés sont la résultante d'effets indirects. Au niveau du LTR, Sheridan et coll. avaient montré que la TSA pouvait conduire à une augmentation de la réinitialisation de la transcription in vitro sur des supports chromatinisés (Sheridan et al., 1997). Enfin, dans des conditions de transcription in vitro utilisant des supports non-chromatinisés, le LTR est un promoteur fort soulignant le rôle suppressif de la chromatine sur son activation.
La chromatine est donc un composant intégral du système de régulation de la transcription du VIH-1 et joue un rôle essentiel dans le contrôle transcriptionnel de l'expression des gènes viraux.
C-4) Le recrutement des facteurs cellulaires
Devant la complexité du promoteur du VIH-1, il apparaît évident que plusieurs facteurs doivent intervenir dans la régulation de la transcription y compris des protéines d'origine cellulaire. L'activité optimale de Tat est sous le contrôle de son interaction avec 2 classes de protéines cellulaires enzymatiques : les kinases dépendantes des cyclines et les histones acétyltransférases. En outre, d'autres facteurs, sont également requis pour potentialiser la transcription, qu'elle soit dépendante ou indépendante de Tat.
C-4-1) Les kinases dépendantes des cyclines
L'hyperphosphorylation du CTD de la large sous-unité de la RNAPII est absolument requise pour le mécanisme de la trans-activation par Tat (Chun and Jeang, 1996; Okamoto et al., 1996; Parada and Roeder, 1996; Yang et al., 1996). Deux kinases dépendantes des cyclines, appartenant à 2 complexes distincts, ont été identifiées pour phosphoryler le CTD et être des co-facteurs de la protéine Tat (Price, 2000; Taube et al., 1999). Les 2 kinases impliquées sont CDK7 et CDK9 qui appartiennent respectivement aux complexes TFIIH et P-TEFb.
C-4-1-1) Le complexe TFIIH
TFIIH est un facteur général de transcription qui contient 9 polypeptides (ERCC3/XBP, ERCC2/XPD, p62, p54, p44, CDK7, cycline H, MAT1 et p34) et qui intervient à la fois dans la régulation de la transcription et dans la réparation de l'ADN (revue dans (Maldonado and Reinberg, 1995)). Au niveau de la transcription TFIIH fait partie du complexe d'initiation et fonctionne dans les étapes d'initiation et de démarrage du promoteur lorsque les ARN messagers ont une taille inférieure à 50 bases environ (Zawel et al., 1995). Le complexe possède une activité CTD kinase qui réside dans l'unité CDK7 (Shiekhattar et al., 1995). En association avec cycline H et MAT1, CDK7 forme un complexe stable trimérique appelé CAK (cdk-activating kinase). CAK existe sous une forme seule mais peut être également associée à ERCC2 ou aux autres composants du complexe TFIIH. En plus de l'implication de ce complexe dans le contrôle du cycle cellulaire, CAK a été postulé pour être la kinase majeure capable de phosphoryler le CTD lors des réactions de transcription (Akoulitchev et al., 1995; Svejstrup et al., 1996), conduisant ainsi plusieurs groupes à examiner si Tat pouvait agir avec TFIIH/CAK.
Différentes études ont montré que Tat interagit avec TFIIH et stimule la phosphorylation du CTD par CDK7. Cependant les opinions divergent en ce qui concerne la liaison entre Tat et les sous-unités de TFIIH. Selon Cujec et coll., Tat lierait spécifiquement et directement CDK7 via son domaine d'activation (Cujec et al., 1997) alors que Parada et Roeder rapportent que Tat interagirait avec CDK7 via la sous-unité p62 du complexe TFIIH (Parada and Roeder, 1996). Des conclusions différentes ont été faites par Garcia-martinez et coll. qui ont montré que Tat liait et activait seulement une petite fraction de CDK7 associée à TFIIH mais pas sous la forme du trimère CAK (Garcia-Martinez et al., 1997) (revue dans (Jones, 1997)). L'activité de CDK7 semble intervenir dans les étapes précoces de post-initiation et favoriser la transition vers l'élongation productive. En effet, l'utilisation d'inhibiteur de CDK7 réduit de façon dramatique la formation des longs ARN messagers dont la production dépend de Tat mais n'affecte pas la synthèse des courts, indépendante de l'activité de Tat sur le promoteur du VIH-1. De façon similaire, la sur-expression de CDK7 stimulerait préférentiellement la synthèse des ARN messagers longs, effet pouvant être inhibé par l'utilisation d'un CDK7 muté dans la région codant pour l'activité kinase de la protéine (Cujec et al., 1997). Cependant, le rôle de CDK7 dans la trans-activation par Tat n'est pas encore très clair, car des travaux plus récents apportent des conclusions contradictoires. En effet, l'immunodéplétion de CAK dans des conditions où TFIIH n'est pas affecté n'a aucune conséquence sur la trans-activation par Tat in vitro (Chen and Zhou, 1999). Finalement, TFIIH aurait un effet inhibiteur sur la phosphorylation de CDK9, CDK9 phosphorylée étant la forme active de la kinase (Zhou et al., 2001). Comme TFIIH est associé au complexe de pré-initiation de la transcription du promoteur du VIH-1 mais pas au complexe d'élongation de la transcription (Ping and Rana, 1999), TFIIH pourrait agir lors de l'initiation permettant une première phosphorylation du CTD au niveau des serines 5 tout en empêchant l'action de P-TEFb. La libération du complexe permettrait l'autophosphorylation de CDK9 qui deviendrait alors active pour phosphoryler les serines 2 du CTD et permettre l'élongation.
Il serait toutefois nécessaire d'effectuer des études supplémentaires pour mieux définir le rôle de CDK7/TFIIH dans la trans-activation par Tat.
C-4-1-2) Le complexe P-TEFb/Tat/TAR
Le complexe P-TEFb, initialement identifié chez Drosophila Megalonaster (Marshall and Price, 1995), est constitué par 2 sous-unités : CDK9 et cyclineT1. Cependant une faible fraction de CDK9 interagit aussi avec 2 autres formes de cyclineT appelées cyclineT2a et cyclineT2b ou avec cyclineK (Fu et al., 1999; Peng et al., 1998) mais Tat fonctionnerait uniquement avec cyclineT1 (Wimmer et al., 1999). CDK9 possède une activité kinase similaire à celle de cdc2 (Garriga et al., 1996) et permet l'élongation de la transcription de nombreux promoteurs y compris celui du VIH-1 en catalysant la phosphorylation du CTD de l'ARNPII (Mancebo et al., 1997; Zhu et al., 1997). CyclineT1, l'autre composant du complexe P-TEFb interagit directement avec le domaine d'activation de la protéine Tat (Wei et al., 1998). Cette liaison entre Tat et P-TEFb augmente l'affinité de Tat à l'ARN TAR et requiert une séquence spécifique localisée dans la structure en boucle de TAR (Wei et al., 1998). Des analyses biochimiques ont montré l'importance du zinc pour ces interactions mais également celle de la cystéine 261 de la cyclineT1 dont la mutation empêche la reconnaissance entre Tat/cyclineT1 et TAR. Pour cette dernière raison Tat est incapable d'activer son promoteur dans les cellules murines, la cystéine 261 étant substituée par une tyrosine (Garber et al., 1998).
Contrairement au complexe TFIIH, le rôle de CDK9 et de cyclineT1 est bien défini, P-TEFb étant requis dans la trans-activation par Tat. Tout d'abord, l'utilisation d'un dominant négatif de CDK9 bloque la trans-activation par Tat et la réplication du VIH-1 (Gold et al., 1998; Mancebo et al., 1997; Zhu et al., 1997). Ensuite, l'immunodéplétion de CDK9 ou cyclineT1, à partir d'extraits nucléaires de cellules HeLa, bloque l'élongation de la transcription et la trans-activation par Tat (Mancebo et al., 1997; Wei et al., 1998). Enfin, dans les cellules murines, l'expression de la cyclineT1 humaine permet à Tat de récupérer sa fonction (Bieniasz et al., 1998; Garber et al., 1998). Ainsi, il apparaît que les résidus de cyclineT1, critiques pour l'interaction avec Tat et TAR, ne sont pas extrêmement conservés et qu'ils pourraient ne pas être nécessaires pour la fonction cellulaire de P-TEFb. En outre la fonction du complexe P-TEFb dans la régulation du l'activation du promoteur dépendant de l'ARNPII semble être un phénomène actif. En effet, différentes études ont montré que P-TEFb était capable de contrebalancer les effets des facteurs négatifs d'élongation, DSIF et NELF. Wada et coll. suggèrent grâce à des expériences d'immunodéplétion qu'in vitro la seule activité de P-TEFb serait de contrecarrer l'effet inhibiteur de DSIF. Selon leurs résultats, P-TEFb stimulerait la transcription en présence de DSIF mais n'aurait pas d'effet détectable seul (Wada et al., 1998). DISF pourrait être impliqué dans la transcription dépendante de Tat car l'homologue humain p160 de Spt5 chez la levure est un composant du complexe DSIF et cet homologue, initialement appelé Tat-CT1 semble être nécessaire pour la trans-activation par Tat dans des tests de transcription in vitro (Wu-Baer et al., 1998).
Ainsi, Tat protéine virale, établirait des connections avec les principaux complexes de régulation de la transcription cellulaire afin de les détourner, au profit du virus, et de permettre l'expression de l'ensemble des gènes viraux.
C-4-2) Les histones acétyltransférases (HATs)
Ces enzymes ont été initialement décrites comme co-facteurs transcriptionels, sont responsables du transfert d'un groupe acétyl sur les lysines de la queue des histones. L'acétylation spécifique des histones nucléosomaux est en étroite corrélation avec l'augmentation de l'accessibilité de la chromatine et l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes (Roth and Allis, 1996; Sternglanz, 1996; Wade et al., 1997).
Des expériences réalisées par Van Lint et coll. en 1996 ont suggéré pour la première fois que le promoteur du VIH-1 pouvait être régulé par des activités HATs. En effet, le traitement de cellules-T, infectées de façon latente, par la TSA, un inhibiteur des HDACs, a pour conséquence une activation de la transcription et un remodelage de la chromatine. Ces évènements sont similaires à ceux observés dans les mêmes cellules activées, mais non traitées (Van Lint et al., 1996). Ces résultats, par la suite confirmés lors d'une étude in vitro, ont aussi étaient complétés par des résultats montrant une corrélation entre l'augmentation de l'acétylation de l'histone H4 et l'activation du promoteur du VIH-1 (Sheridan et al., 1997). Tat, comme d'autres facteurs de transcription, est capable d'interagir directement avec des HATs (Benkirane et al., 1998; Col et al., 2001; Hottiger and Nabel, 1998; Marzio et al., 1998). Les deux protéines HATs initialement identifiées par Benkirane et coll. sont p300 et PCAF et ce n'est que très récemment que hGcn5 a été identifiée comme co-facteur de Tat (Col et al., 2001). Ces facteurs et leur activité HAT sont requis pour la trans-activation par Tat puisque l'utilisation de protéines mutées au niveau du domaine enzymatique entraîne une diminution sévère de la transcription. Ces données sont en parfait accord avec les études précédentes qui montrent l'importance de l'acétylation des histones pour augmenter la transcription.
Cependant la présence des HATs dans le complexe de transcription n'est pas importante seulement pour l'acétylation des histones. En effet, très récemment Kiernan et coll. ont montré que Tat était directement acétylée (Kiernan et al., 1999), ce qui a été confirmé par différents laboratoires (Col et al., 2001; Deng et al., 2000; Ott et al., 1999). Au sein de la protéine, 3 lysines ont été identifiées pour être modifiées par acétylation : la lysine 28 ou K28, localisée dans le domaine d'activation de la protéine et les lysines 50 et 51 ou K50 et K51 qui font parties du domaine ARM. Les HATs responsables de l'acétylation de Tat sont PCAF pour la K28 et p300 et hGcn5 pour la K50 et la K51. Comme c'est le cas de nombreuses modifications post-traductionnelles, l'acétylation de Tat engendre des conséquences sur sa fonction dans la transcription. Tout d'abord, elle module l'interaction de Tat avec le complexe P-TEFb requis pour la transcription. En effet, l'acétylation de K28 entraîne une augmentation de l'affinité entre Tat et la cyclineT1 et une augmentation de la liaison du complexe préformé Tat/P-TEFb à l'ARN TAR (Kiernan et al., 1999). La liaison entre Tat et TAR est nécessaire pour la transcription et il a été montré in vitro que lorsque Tat n'est pas modifiée, la demi-vie de cette interaction est de 41s (Wang et al., 1998). Ceci n'est pas compatible avec les cinétiques rapides d'activation requises lors de la trans-activation par Tat (Jeang and Berkhout, 1992). Aussi, in vivo, il doit exister des formes de Tat qui ont des demi-vies d'interaction avec TAR plus courtes. L'étude de Kiernan et coll. puis d'autres ont montré que l'acétylation de la K50 par p300 entraînait la dissociation entre Tat et TAR suggérant ainsi que la forme de Tat acétylée au niveau de la K50 pouvait être une des formes de Tat compatible avec les cinétiques d'activation rapides, donc une forme fonctionnelle de la protéine. En conclusion, il est maintenant largement admis que l'acétylation directe de la protéine Tat est un moyen de réguler étroitement son activité transcriptionnelle (Figure 20).
Bien qu'assez récente, la découverte de l'implication des HATs dans la régulation de l'activation du promoteur du VIH-1 a permis de mettre en évidence un double système régulateur faisant intervenir l'acétylation : tout d'abord au niveau de la chromatine avec l'acétylation des histones bien qu'aucune donnée ne permette d'affirmer directement que p300 ou PCAF ou d'autres HATs sont responsables de l'acétylation des histones de nuc-1 ; et au niveau de Tat où l'acétylation permet de réguler deux étapes cruciales de la trans-activation qui sont la liaison au complexe P-TEFb et l'interaction avec l'ARN TAR.
C-4-3) Les autres facteurs de transcription
Les autres facteurs cellulaires capables d'intervenir dans la transcription du VIH-1 peuvent être classés en 2 catégories : les éléments négatifs et les éléments positifs.
La région modulatrice du promoteur contient un domaine NRE sur lequel des facteurs cellulaires peuvent se fixer pour réguler négativement la transcription. Brièvement, ces facteurs sont le complexe AP1, composé entre autre par des protéines de la famille c-jun et c-fos, COUP-TF (Chicken Ovalbumine Upstream Promoter-Transcription Factor) (Lee et al., 1994) et le facteur USF (Upstream Stimulatory Factor) (Giacca et al., 1992). Relativement peu d'études sont réalisées sur le rôle de ces facteurs et les éléments NRE, de ce fait leur implication réelle dans la régulation du promoteur reste à définir.
Au contraire, les éléments positifs ont fait l'objet de nombreuses études. Le plus analysé est le facteur NF-kB dont l'implication dans l'activation de la transcription du VIH-1 est maintenant certaine. Le facteur NF-kB est un hétérodimère constitué de deux sous-unités, l'une de 50 KDa (p50) et l'autre de 65 KDa (p65) encore appelée Rel A. Il existe cependant d'autres protéines qui appartiennent à cette famille et qui présentent des homologies dans leur domaine N-terminal. Cette homologie permet la formation d'homodimère ou d'hétérodimère dont une large partie est capable, in vitro, de lier les sites kB du promoter du VIH-1. Cependant la forme p50/p65 est la plus représentée dans ce contexte (revue dans (Liou and Baltimore, 1993)). L'activation par NF-kB semble être une composante importante dans la régulation du promoteur puisque la délétion des sites kB entraîne une absence d'activation du LTR par les activateurs classiques de cette voie c'est-à-dire le TNF-α, l'IL-1 ou encore les mitogènes des cellules T. Différentes études datant de plus 10 ans, ont montré que NF-kB agirait en synergie avec Tat pour activer le promoteur (Liu et al., 1992) et plus récemment, en accord avec ces observations Barboric et coll. ont trouvé que l'activation par NF-kB nécessitait le complexe P-TEFb. De plus, p65 interagirait directement avec le complexe P-TEFb (Barboric et al., 2001) suggérant l'existence d'une action concertée entre NF-kB, P-TEFb et Tat au niveau du promoteur. Au contraire, West et coll. rapportent, que NF-kB serait capable d'agir indépendamment de P-TEFb, puisque lorsqu'ils utilisent le mutant catalytique de CDK9 (D167N) l'activation par NF-kB n'est pas affectée (West et al., 2001). Enfin, comme mentionné dans le chapitre précédant, Tat serait capable d'induire l'activation de NF-kB (Demarchi et al., 1996), laissant supposer une réelle importance de ce facteur dans la régulation du promoteur du VIH-1 bien que l'étude de Berkhout et Jeang montre que la trans-activation par Tat du LTR est indépendante de NF-kB (Berkhout and Jeang, 1992). D'ailleurs, en accord avec ces résultats et contrairement à Tat, NF-kB active la transcription en fonction du niveau basal d'activité du promoteur et de l'état de la chromatine (El Kharroubi et al., 1998).
Trois sites de liaison à Sp1 font suite aux éléments de réponse à NF-kB. Ces sites sont nécessaires à la transcription du VIH-1 mais l'implication de Sp1 lui-même est moins certaine. Sp1 est un facteur de transcription de 95 à 105 KDa contenant 3 structures en doigt de zinc requises pour l'interaction à l'ADN. Alors qu'une étude initiale avait montré l'effet activateur de Sp1 sur le promoteur du VIH-1 (Jones et al., 1986), la découverte d'une interaction directe entre Tat et Sp1 (Jeang et al., 1993) a incité des études plus poussées. Le même laboratoire a montré par la suite que Tat régulait la phosphorylation de Sp1 en établissant un pont entre la DNA-PK, kinase cellulaire, et Sp1. L'utilisation de mutants de Tat incapables de lier Sp1 entraînent un retard important de la réplication suggérant un rôle essentiel de cette interaction (Chun et al., 1998; Vlach et al., 1995) mais n'excluant pas un défaut ailleurs qu'au niveau de la formation du complexe Tat/Sp1. Toutefois, l'utilisation d'extraits nucléaires de cellules HeLa fractionnés sur colonnes de chromatographie a permis de mettre en évidence le rôle de Sp1 à la fois dans l'activation basale du promoteur, mais aussi, dans celle induite par Tat (Sune and Garcia-Blanco, 1995).
Enfin, Tat interagirait aussi avec TBP (TATA-binding protein) (Kashanchi et al., 1994), protéine qui se fixe à la boîte TATA. TBP est associée à des TAFs (TBP-associated factor) pour former le complexe TFIID. Ce complexe fait partie de la famille des facteurs généraux de transcription qui interviennent à la fois dans la transcription basale et dépendante d'un activateur. Le promoteur du VIH-1 n'est pas régulé par TBP, sa présence n'étant pas un facteur limitant pour la trans-activation. Le recrutement de TBP se ferait très tôt définissant l'étape de formation du complexe d'initiation (revue dans (Burley and Roeder, 1996; Struhl, 1996)). Cependant, l'existence de cette interaction entre Tat et TBP a été controversée et une étude plus récente rapporte que la présence de Tat au niveau du promoteur ne suffit pas à recruter TBP. En revanche la ciblage de TBP au promoteur via le système de fusion GAL4 permet, en présence de Tat, d'augmenter l'activité du promoteur du VIH-1 (Xiao et al., 1997).
Il est toutefois intéressant de noter qu'il existe, en plus des protéines décrites, de très nombreux autres facteurs de transcription capables d'interagir avec le promoteur du VIH-1. Ces facteurs régulent positivement ou négativement la transcription via des interactions de types protéines/ADN et protéines/protéines. Tous ces facteurs ont été regroupés dans une liste très complète par Pereira et coll. (Pereira et al., 2000).
L'ensemble des études effectuées sur ces facteurs révèle à l'évidence qu'ils sont importants pour le contrôle du promoteur du VIH-1 indépendamment ou en fonction de la présence du facteur viral de transcription Tat.
C-5) Les mécanismes d'actions et les régulations
Compte tenu de la multiplicité des facteurs qui interviennent dans la régulation du promoteur du VIH-1, il est assez difficile d'envisager l'intégration de tous dans un même modèle d'autant plus qu'ils interviennent vraisemblablement séquentiellement au cours des différentes étapes de la transcription. Les interactions multiples de Tat avec ses co-facteurs laissent supposer que Tat pourrait jouer un rôle spécifique et essentiel au sein de chaque étape, depuis l'initiation jusqu'à l'élongation de la transcription.
C-5-1) L'initiation
L'implication de Tat dans l'initiation de la transcription fait l'objet d'un débat permanent, ceci en conséquence notamment des confusions qu'il existe autour du recrutement du complexe TFIIH dans la transcription dépendante de Tat. En effet, bien que la phosphorylation du CTD de l'ARNPII par CDK7 soit stimulée par Tat, il a été montré, in vitro, dans un système où la transcription dépend de Tat, que le CTD peut-être hyperphosphorylé avec la même efficacité, par CDK7 en présence et en absence de Tat (Isel and Karn, 1999; Keen et al., 1997). Il est vrai que la phosphorylation du CTD est importante pour activer la transcription, puisque sa délétion entraîne une perte de la trans-activation par Tat, mais CDK7 n'est pas seul à intervenir puisque Tat permet aussi le recrutement de CDK9. L'ARN TAR est produit par l'élongation de RNAPII ce qui suggère que l'initiation doive être amorcée. Or Tat est recrutée au niveau du promoteur via son interaction avec TAR ce qui ne semble pas compatible à un rôle de Tat dans l'initiation. Pourtant Tat interagit aussi avec les facteurs activateurs des séquences localisées en amont de TAR, suggérant que via ces facteurs tels que Sp1, TFIID, ect. Tat pourrait être impliquée dans l'initiation. Plusieurs hypothèses convergent vers une première activation du promoteur via une déstabilisation de la chromatine, qui serait indépendante de Tat mais suffisante pour permettre la production d'ARN messagers précoces et courts dont celui de Tat. Les interactions entre Tat et les facteurs initiateurs pourraient s'expliquer par la nécessité de réactiver, en fonction du facteur viral cette fois-ci, l'initiation de la transcription permettant d'abord un contrôle viral de cette étape et aussi une transcription plus rapide et plus efficace.
De nombreuses études sont encore à faire pour élucider le rôle de Tat dans l'initiation. Cependant, étant donné la promiscuité des évènements, il est compréhensible qu'en fonction des techniques et des stratégies adoptées pour étudier ce phénomène, des divergences dans les résultats existent.
C-5-2) L'élongation
Via son interaction avec le complexe P-TEFb, Tat est incontestablement impliquée dans l'activation de l'élongation. Il existe cependant des incertitudes concernant l'aspect séquentiel du processus. En effet, est-ce que Tat s'associe d'abord à P-TEFb puis à TAR ou est-ce que Tat, préalablement associé à TAR permet le recrutement de P-TEFb ? Bieniasz et coll. favoriseraient plutôt la première hypothèse. Leur travail montre qu'indépendamment de TAR, Tat est capable d'interagir avec cyclineT1 d'origine humaine et murine. Par contre, seule la forme humaine permet de former le complexe Tat/cyclineT1/TAR, la forme murine étant incapable d'interagir avec TAR (Bieniasz et al., 1998). En outre, le travail de Wei et coll. montre que Tat seul n'est pas capable de lier TAR (Wei et al., 1998). En revanche, Keen et coll. pensent que Tat en se liant à TAR permettrait un changement de conformation de la structure tige/boucle permettant au complexes co-activateurs de se lier (Keen et al., 1997). Malgré tout de plus en plus de résultats favorisent la première hypothèse. En effet, l'étape d'activation de l'élongation fait également intervenir des HATs qui en acétylant la protéine Tat favorise son interaction avec cyclineT1 mais aussi avec TAR (Kiernan et al., 1999). Ce complexe tri-ternaire ainsi formé (Tat/P-TEFb/TAR), Tat activerait l'activité kinase de CDK9, permettant ainsi l'hyperphosphorylation du CTD de l'ARNPII conduisant à l'élongation productive (Figure 20). La nature des sérines phosphorylées par CDK9 dépendrait de la présence ou pas de Tat. Zhou et coll. qui sont défavorables à l'implication de CDK7 dans la trans-activation par Tat, proposent en utilisant le complexe P-TEFb recombinant qu'en absence de Tat, CDK9 phosphorylerait uniquement les serines 2 mais que la présence de Tat permettrait une phosphorylation des sérines 2 et 5. Tat modifierait alors la spécificité du substrat de P-TEFb, ce qui serait favorable au non recrutement du complexe TFIIH (Zhou et al., 2001).
Bien que le mécanisme exact ne soit pas encore parfaitement connu, Tat est essentiel à l'activation de l'élongation. Cette étape fait intervenir en plus des facteurs viraux Tat et TAR, le complexe P-TEFb et PCAF qui permet, via sa capacité à acétyler la K28 de Tat, de réguler une partie des interactions protéines/protéines.
L'implication de Tat dans les étapes plus tardives de l'élongation est assez mal documentée. A l'origine, ce processus nécessite la libération active et dynamique de Tat depuis TAR (Keen et al., 1997). Ce processus est régulé encore une fois par acétylation (Col et al., 2001; Deng et al., 2000; Kiernan et al., 1999; Ott et al., 1999). p300 fait partie du complexe de transcription et permet, via des mécanismes encore méconnus, l'acétylation de la K50 de la protéine Tat. Cette lysine est localisée dans le domaine ARM et elle est spécifiquement requise pour l'interaction Tat/TAR puisqu'elle contacte directement l'ARN (Richter et al., 2002). L'acétylation de la K50 permet la dissociation de Tat qui partirait alors avec le complexe d'élongation de la transcription. Une étude très récente, fondée sur une analyse de structure montre que sous sa forme acétylée au niveau de la K50, Tat lierait le bromo-domaine de la protéine PCAF (Mujtaba et al., 2002). PCAF étant un des composants du complexe d'élongation, cette nouvelle interaction entre Tat et PCAF pourrait permettre à Tat d'être aussi associée à ce complexe. Ainsi PCAF interviendrait à 2 niveaux dans la régulation de Tat : tout d'abord dans l'acétylation de la K28, régulant l'interaction de Tat à P-TEFb et via son interaction à Tat acétylée au niveau de la K50. Les auteurs proposent que PCAF permettrait alors la libération de Tat depuis TAR mais des études antérieures faites avec des peptides de Tat acétylés montraient bien que la forme K50 acétylée de la protéine n'étaient plus capable de lier l'ARN TAR (Kiernan et al., 1999). De façon évidente, la dissociation de Tat/TAR est un processus actif et régulé qui est important pour l'implication de Tat dans l'élongation.
L'association de Tat au complexe de l'élongation a été montrée in vitro (Keen et al., 1997; Keen et al., 1996), mais peu d'études ont été faites pour le moment, les étapes antérieures demeurant encore confuses et incomplètes. Dans les années futures, des investigations devraient être faites dans ce sens.
Un des aspects particulièrement intéressant dans l'étude du VIH-1 et notamment dans l'analyse de l'étape de transcription est de voir avec quelle efficacité et quel contrôle le virus utilise l'ensemble du système cellulaire humain pour se développer. Pourtant, le processus de transcription est comme décrit dans la première partie un mécanisme extrêmement complexe et organisé. Les études faites sur les processus de transcription sont autant d'éléments importants qui contribuent à comprendre comment le virus peut s'exprimer, compréhension essentielle dans une optique appliquée et thérapeutique. Réciproquement l'étude des mécanismes de la transcription du VIH-1 permet aussi des avancées majeures dans l'étude du contrôle transcriptionnel de l'expression des gènes.
D) Références bibliographiques
Ce chapitre est issu de la THESE de Doctorat de
Vanessa Bres, 25 Novembre 2002, Université Montpellier II
"Etude des modifications post-traductionnelles de la protéine TAT du virus de l'immunodéficience humaine
de type-1 : rôle dans la régulation de son activité transcriptionnelle"
Directeur de Thèse : Monsef Benkirane, IGH, UPR CNRS 1142
©Copyright Université Montpellier II 2002
Created: 06/01/2003
Last updated: Friday, 22-Sep-2023 18:15:41 CEST
Author: Vanessa Bres
bres@salk.edu
Editor: Chantal Ginestoux
IMGT Home page |
IMGT Repertoire (IG and TR) |
IMGT Repertoire (MH) |
IMGT Repertoire (RPI) |
IMGT Index |
IMGT Scientific chart |
IMGT Education |
IMGT Latest news 
© Copyright 1995-2024 IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® | Terms of use | About us | Contact us | Citing IMGT